I. Giới thiệu

Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) đã được ứng dụng rộng rãi trên quy mô toàn cầu từ giữa thế kỷ XX. Theo số liệu thống kê từ Hội đồng Bảo vệ Cây trồng Anh, hiện có khoảng 860 hoạt chất được sử dụng trong các công thức thương mại. Những chất này thuộc hơn 100 nhóm hóa học khác nhau, trong đó tiêu biểu là benzoylurea, carbamate, lân hữu cơ (organophosphorus), pyrethroid, sulfonylurea và triazine. Tính chất lý - hóa của thuốc BVTV có sự biến thiên lớn: một số hợp chất chứa halogen, số khác chứa photpho, lưu huỳnh hoặc nitơ. Những dị nguyên tử này đóng vai trò quan trọng trong việc định danh và phát hiện. Về đặc tính lý tính, một số hợp chất rất dễ bay hơi, trong khi số khác thuộc nhóm không bay hơi. Sự đa dạng về cấu trúc này gây khó khăn đáng kể trong việc phát triển một phương pháp phân tích đa dư lượng (multiresidue method) "phổ biến" có phổ phân tích rộng tối đa.

Việc thiết lập các phương pháp xác định dư lượng là yêu cầu cấp thiết. Mức giới hạn dư lượng tối đa (MRLs) đã được luật hóa đối với thực phẩm và nước uống tại hầu hết các quốc gia nhằm ngăn ngừa các tác động tiêu cực đến sức khỏe cộng đồng và thúc đẩy thực hành nông nghiệp tốt (GAP). Ngoài ra, dư lượng thuốc diệt cỏ tồn dư trong đất từ vụ trước có thể ức chế sự phát triển của cây trồng vụ sau, trong khi dư lượng trong nước bề mặt gây nguy hại cho hệ sinh thái dưới nước. Vì những lý do này, nhiều phòng thí nghiệm đã triển khai công tác giám sát MRLs hoặc định tính và định lượng dư lượng thuốc BVTV trong các nền mẫu môi trường. Trong bối cảnh này, việc vận hành đồng thời nhiều phương pháp đơn dư lượng (single residue methods) thường không đảm bảo tính kinh tế. Cần lưu ý rằng, theo quy định định kỳ, mọi đơn vị đăng ký hoạt chất mới đều phải cung cấp quy trình phân tích dư lượng tương ứng.

Tùy theo mục đích, việc xác định dư lượng có thể triển khai theo hướng phân tích mục tiêu (targeted analysis) hoặc không mục tiêu (non-targeted analysis). Một ví dụ về phân tích mục tiêu là kiểm tra MRL trong thực phẩm, nơi các hoạt chất cần phân tích được xác định cụ thể theo quy định pháp lý. Các định nghĩa về dư lượng này có thể bao gồm các sản phẩm chuyển hóa hoặc phân hủy có hoạt tính. Ngược lại, quy định của EU về dư lượng trong nước uống chưa thiết lập các định nghĩa chi tiết. Hơn nữa, dư lượng trong đất hoặc nước mặt vẫn chưa được quy định chặt chẽ. Trong những trường hợp đó, các chất chuyển hóa hoặc sản phẩm phân hủy có thể chưa được nhận diện, và việc phát hiện chúng là một phần của nhiệm vụ phân tích. Cả hai loại hình phân tích này đều đòi hỏi những quy trình xử lý khác nhau và các thiết bị đo đạc chuyên dụng.

II. Sự tiến hóa của các kỹ thuật phân tích

Trong những thập kỷ qua, các phương pháp xác định lượng vết (trace levels) thuốc BVTV đã thay đổi đáng kể. Từ đầu những năm 1970, hầu hết các phân tích dư lượng thông thường được tiến hành bằng sắc ký khí (GC) kết hợp với các đầu dò chọn lọc như: bắt giữ điện tử (ECD), nitơ-photpho (NPD) hoặc ion hóa ngọn lửa (FID). Việc xác nhận kết quả từng đòi hỏi sử dụng hệ thống GC được trang bị các loại cột hoặc đầu dò bổ trợ. Ngày nay, với sự ra đời của GC kết hợp với khối phổ (MS), việc định danh và xác nhận đồng thời dư lượng có thể thực hiện trên cùng một hệ thống trong một chu kỳ phân tích. Trong hầu hết các trường hợp, độ nhạy của GC-MS tương đương với các đầu dò GC truyền thống. Tính chọn lọc của GC-MS có thể được tối ưu hóa thông qua việc lựa chọn các ion phân tử và ion mảnh đặc trưng nhằm loại bỏ nhiễu nền từ ma trận mẫu.

Trước đây, các phương pháp dựa trên sắc ký lỏng (LC) ít được phổ biến hơn, do các đầu dò UV, mảng diode (PDA) và huỳnh quang truyền thống thường có độ chọn lọc và độ nhạy thấp hơn so với GC. Tuy nhiên, sự phát triển của kỹ thuật ion hóa ở áp suất khí quyển (API) đã tạo nên một bước ngoặt lớn. So với các đầu dò truyền thống, kỹ thuật phun điện tử (ESI) hoặc ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) kết hợp với hệ thống MS đã tăng độ nhạy của phương pháp LC lên vài bậc độ lớn (orders of magnitude). Hơn nữa, các kỹ thuật chuyển đổi cột (column switching) và quy trình làm sạch mẫu phức tạp trở nên không cần thiết nếu sử dụng khối phổ kế song song (MS/MS) vận hành ở chế độ theo dõi phản ứng chọn lọc (SRM). Do LC-MS/MS loại bỏ hiệu quả các tín hiệu nhiễu trong chế độ SRM, tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) tăng đáng kể, cho phép tận dụng tối đa ngưỡng độ nhạy của thiết bị.

Do đó, mục đích của bài tổng quan này là hệ thống hóa các ion tiền thân và ion sản phẩm điển hình phù hợp để định danh trên LC-MS/MS cho 500 loại thuốc BVTV (với điều kiện chúng có khả năng ion hóa bằng ESI) và đánh giá độ nhạy đạt được. Khả năng ứng dụng của GC-MS với nguồn ion hóa va chạm electron (EI) cũng được kiểm tra cho cùng danh sách hoạt chất. Các dữ liệu về ion mảnh đặc trưng sẽ được cung cấp nếu định danh được. Việc lựa chọn giữa hai phương án định lượng phụ thuộc trực tiếp vào độ nhạy; vì lý do này, nồng độ chất phân tích nhỏ nhất (LOD/LOQ) cần thiết cho GC-MS hoặc LC-MS/MS cũng được liệt kê. Cuối cùng, phạm vi ứng dụng của các phương pháp đa dư lượng dựa trên GC-MS hoặc LC-MS/MS sẽ được trình bày tổng quát.

III. Tiêu chí lựa chọn hoạt chất phục vụ đối sánh

Như đã đề cập, có khoảng 860 hoạt chất hiện đang được sử dụng. Ngoài ra, các nhà phân tích còn phải xem xét các chất chuyển hóa, sản phẩm phân hủy và thuốc BVTV thuộc nhóm khó phân hủy (persistent). Hiện nay, không có một kỹ thuật đơn lẻ nào có thể phân tích toàn diện gần 900 chất phân tích này.

Vì lý do đó, việc lựa chọn các hoạt chất "đại diện quan trọng" là cần thiết. Quy trình được bắt đầu bằng việc loại trừ hơn 140 loại thuốc BVTV không phù hợp để so sánh giữa GC-MS và LC-MS/MS, bao gồm:

• 9 dithiocarbamate, 48 tác nhân sinh học (vi khuẩn, nấm, virus...) và 29 hợp chất vô cơ (do không thể phân tích bằng phương pháp đa dư lượng).

• 35 pheromone (do ít có khả năng để lại dư lượng).

• Các dạng đồng phân tương tự (ví dụ: alpha, beta, theta và zeta-cypermethrin) sẽ được xem xét dưới một đại diện duy nhất.

Các tiêu chí sau đây được áp dụng để chọn lọc các hoạt chất quan trọng nhất:

1. Tình trạng sản xuất: Hoạt chất phải nằm trong ấn bản thứ 13 của cuốn "The Pesticide Manual" về các loại thuốc đang được sản xuất thực tế.

2. Tính pháp lý về dư lượng.

3. Tần suất xuất hiện dư lượng: Ưu tiên các chất thường xuyên được phát hiện trong các chương trình giám sát thực phẩm.

4. Bao hàm các chất chuyển hóa: Xem xét các sản phẩm chuyển hóa/phân hủy có trong định nghĩa dư lượng của các quy định pháp luật.

5. Tính tương thích thiết bị: Phải áp dụng được ít nhất một trong hai kỹ thuật GC-MS hoặc LC-MS/MS.

Dựa trên các tiêu chí này, 422 thuốc BVTV và 42 chất chuyển hóa quan trọng đã được chọn lọc. Ngoài ra, 36 loại thuốc BVTV dù đã ngừng sản xuất nhưng vẫn được đưa vào danh sách do vẫn tồn tại quy định về MRLs. Tổng số 500 hợp chất thu được (Bảng 1) bao gồm: 81 loại lân hữu cơ, 43 carbamate, 40 clo hữu cơ, 26 sulfonylurea, 24 triazole, 23 triazine, 22 dẫn xuất urê, 19 pyrethroid, 12 aryloxyphenoxypropionate và 10 acid aryloxyalkanoic. Theo phân loại trong Sổ tay thuốc bảo vệ thực vật, 207 hợp chất còn lại thuộc về 90 nhóm hóa học khác.

Bảng 1. Các ion điển hình được chọn cho GC-MS hoặc chuyển tiếp được sử dụng trong LC-MS/MS và độ nhạy thu được bằng cả hai kỹ thuật

Quy định của EU có thể được tìm thấy trên các trang web: http://europe.eu.int/eur-lex/en/search/search_lif.html  hoặc http://europe.eu.int/eur-lex/lex/en/ repert/035020.htm

^b [M+NH4] ⁺ dùng làm ion chuẩn phân tử.

^c Chất chuyển hóa được quy định tại EU.

^d Chất phân tích yêu cầu các điều kiện HPLC đặc biệt để phát hiện với ESI–MS/MS.

^e Ion chuẩn phân tử là [M–OH] ⁺ .

^f Tài liệu tham khảo 2 không báo cáo ion sản phẩm.

^g Ion chuẩn phân tử là [(M–O)/2] ⁺ .

^h Sự phân hủy định lượng của thuốc trừ sâu xảy ra trong ống tiêm GC.

ⁱ Tài liệu tham khảo 1 không báo cáo ion sản phẩm.

Tổng cộng có 172 loại thuốc diệt cỏ, 171 loại thuốc trừ sâu, 105 loại thuốc diệt nấm và 52 hợp chất thuộc các nhóm khác (như thuốc diệt ve, diệt khuẩn, chất trợ lực diệt cỏ, thuốc diệt động vật thân mềm, diệt tuyến trùng, chất điều hòa sinh trưởng thực vật và chất hiệp đồng) đã được lựa chọn. Khoảng 90% các loại thuốc BVTV do Ủy ban Châu Âu (EU) quy định đều được liệt kê trong danh mục này. Cần lưu ý rằng phần lớn các hoạt chất bị loại bỏ thuộc nhóm thuốc diệt cỏ, vốn có đặc tính để lại tồn dư thấp trong thực phẩm.

III. Tổng hợp và đánh giá dữ liệu phân tích

Các ion đặc trưng trong khối phổ EI phục vụ định danh bằng GC–MS, cũng như các quá trình chuyển mảnh từ ion tiền thân sang ion sản phẩm đặc trưng trong kỹ thuật LC–MS/MS, được trình bày chi tiết tại Bảng 1.

Hầu hết các nghiên cứu được trích dẫn đều cung cấp thông tin về độ nhạy của thiết bị hoặc phương pháp. Tuy nhiên, việc so sánh trực tiếp các bộ dữ liệu này gặp nhiều khó khăn do sự thiếu đồng nhất. Trong một số trường hợp, độ nhạy được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) của các đỉnh chuẩn sắc ký. Trong khi đó, ở các nghiên cứu khác, độ nhạy lại được tính toán từ giới hạn định lượng (LOQ) của toàn bộ quy trình phân tích. Đối với trường hợp thứ hai, cần phải xem xét đến yếu tố ma trận mẫu và nồng độ của dịch chiết cuối cùng. Hơn nữa, hiệu năng của thiết bị đã được cải thiện đáng kể theo thời gian. Cuối cùng, nhiều thông số vận hành của hệ thống GC–MS và LC–MS/MS cũng ảnh hưởng trực tiếp đến độ nhạy. Đối với GC–MS, đó là các thông số như thời gian lưu (dwell time), loại và chiều dài cột, hoặc chương trình nhiệt độ. Đối với LC–MS/MS, các điều kiện sắc ký (loại dung môi, chất đệm), quá trình ion hóa (điện áp, nhiệt độ, áp suất khí) hoặc các thông số khối phổ (thời gian lưu, năng lượng va chạm) đều có tác động lên kết quả thu được. Do đó, dữ liệu độ nhạy từ các nghiên cứu khác nhau thường không thể so sánh một cách trực giao.

Để đánh giá khách quan độ nhạy của hai kỹ thuật khối phổ và khắc phục các trở ngại nêu trên, các giá trị LOQ trong Bảng 1 đã được ước tính thông qua thực nghiệm trên cả GC–MS và LC–MS/MS trong cùng các điều kiện tương đương.

A. Dữ liệu GC–MS

Phương pháp GC–MS đã được ứng dụng rộng rãi trong phân tích thuốc BVTV suốt nhiều thập kỷ. Hầu hết các ion đặc trưng hiện đã có sẵn trong các sổ tay phân tích, tài liệu ứng dụng từ các nhà sản xuất thiết bị, hoặc các thư viện phổ chuẩn.

Các dung dịch chuẩn với dải nồng độ 1, 10, 100, 1.000 và 10.000 ng/mL đã được phân tích. Nếu một hoạt chất không thể phát hiện ở nồng độ cao nhất trong chế độ giám sát ion chọn lọc (SIM), dữ liệu của nó sẽ bị loại khỏi Bảng 1. Trong các trường hợp còn lại, các ion đặc trưng đều được trình bày. Giá trị LOQ được xác định là nồng độ thấp nhất đảm bảo tỷ lệ S/N ≥ 10 đối với peak có cường độ tín hiệu mạnh nhất.

B. Dữ liệu LC–MS/MS

Các quá trình chuyển mảnh đặc trưng từ ion tiền thân sang ion sản phẩm được tổng hợp từ các công bố gần đây, do hiện chưa có các bộ thư viện dữ liệu tương tự cho LC–MS/MS. Các thông số giám sát phản ứng chọn lọc (SRM) từ các nghiên cứu sử dụng thiết bị ba tứ cực (Triple Quadrupole - QQQ) hoặc bẫy ion tứ cực được ưu tiên lựa chọn.

Độ nhạy của thiết bị LC–MS/MS được đánh giá bằng cách tiêm 20 µL dung dịch chuẩn vào cột pha đảo (Phenomenex Aqua, 50 mm × 2 mm × 5 µm), sử dụng hệ dung môi gradient methanol/nước chứa 5 mmol/L amoni formate. Dữ liệu của khoảng 100 hoạt chất được thu nhận đồng thời bằng nguồn ESI với thời gian lưu cố định là 20 ms cho mỗi lần chuyển đổi SRM.

Quy trình đánh giá trên hệ thống LC–MS/MS bao gồm các dung dịch chuẩn nồng độ 0,1; 1; 10 và 100 ng/mL. Nếu hoạt chất không được phát hiện ở nồng độ cao nhất trong chế độ SRM, dữ liệu sẽ không được ghi nhận tại Bảng 1. Giá trị LOQ được thiết lập tương tự dựa trên tỷ lệ S/N ≥ 10.

IV. Kết luận

A. So sánh phạm vi phân tích

Dữ liệu tại Bảng 1 cho thấy kỹ thuật LC-ESI có khả năng bao quát phổ hoạt chất và sản phẩm chuyển hóa rộng hơn so với GC–MS. Các nhóm hoạt chất như sulfonyl/benzoyl urea, carbamate hay triazine thường được phát hiện tốt hơn hoặc chỉ có thể định danh bằng LC–MS/MS. Ưu thế về phạm vi phân tích của LC–MS/MS còn thể hiện ở nhiều nhóm hóa chất khác, điển hình là các thuốc BVTV lân hữu cơ. Trong tổng số 500 hợp chất, chỉ có 49 chất không cho tín hiệu khi sử dụng LC–MS/MS (kết hợp cả chế độ ESI dương và âm). Ngược lại, có tới 135 hoạt chất không thể phân tích bằng GC–MS (EI), chủ yếu do tính kém bền nhiệt hoặc khó bay hơi của phân tử nguyên vẹn trong hệ thống bơm mẫu.

Bảng 2 trình bày dữ liệu chi tiết cho từng nhóm hóa học, minh chứng rõ ràng rằng một số hoạt chất – vốn thường được xác định bằng đầu dò bắt giữ điện tử (ECD) trong GC – lại không tương thích với hệ thống LC–MS/MS. Điều này đặc biệt đúng với các hợp chất clo hữu cơ và các hoạt chất như benfluralin, chlozolinat, dinobuton... Các ngoại lệ duy nhất là fenchlorphos (phát hiện tốt hơn bằng GC với đầu dò FPD hoặc NPD) và biphenyl (chỉ có thể phân tích bằng GC–MS).

B. So sánh độ nhạy

Cả hai phương pháp GC–MS và LC–MS/MS đều ghi nhận sự biến thiên lớn về độ nhạy, dao động trong khoảng 3–4 bậc độ lớn tùy theo bản chất hoạt chất. Tuy nhiên, kết quả so sánh giá trị trung bình của LOQ khẳng định LC–MS/MS có độ nhạy vượt trội. Đa số các chất phân tích có thể định lượng tin cậy bằng LC–MS/MS trong dung dịch chuẩn ở dải nồng độ 0,1 - 1 ng/mL. Trong khi đó, giá trị LOQ trung bình quan sát được trên GC–MS cao hơn rõ rệt, đạt ngưỡng 100 ng/mL. Sự phân bổ dữ liệu LOQ được minh họa rõ nét trong Hình 3 và Hình 4.

Hình 3. Phân phối dữ liệu giới hạn định lượng (LOQ) của tất cả các loại thuốc trừ sâu/chất chuyển hóa.

Hình 4. Phân phối dữ liệu LOQ của tất cả các loại thuốc trừ sâu phospho hữu cơ.

Kết luận này tiếp tục được củng cố qua Hình 5: ngoài 47 hoạt chất không thể phát hiện bằng LC–MS/MS ở mức 100 ng/mL, chỉ có duy nhất hai chất (acrinathrin và procymidone) đạt độ nhạy tốt hơn trên GC–MS. Có 19 hoạt chất (bromophos-ethyl, chlormephos, chlorobenzilate, chlorpyrifos-methyl, cyanofenphos, cyanophos, cycloate, cyhalofop-butyl, dichlofenthion, diphenylamine, esfenvalerate, fenitrothion, fenvalerate, lambda-cyhalothrin, methacrifos, parathion-methyl, phorate, prothiofos , tolclofos-metyl) cho giá trị LOQ tương đương trên cả hai hệ thống.

Hình 5. So sánh độ nhạy của GC–MS với độ nhạy của LC–MS/MS của các nhóm lớn thuốc trừ sâu khác nhau.

C. Kết luận

Sắc ký khí khối phổ (GC–MS) và sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC–MS/MS) hiện là những kỹ thuật then chốt trong phân tích dư lượng thuốc BVTV. Các kết quả đối sánh về phạm vi ứng dụng và độ nhạy đã chứng minh hiệu suất ưu việt của LC–MS/MS.

Trong quá trình thiết lập phép đo, một ưu điểm khác của LC–MS/MS đã được ghi nhận: do đặc thù độ rộng đỉnh sắc ký trong GC nhỏ, thời gian chu kỳ (cycle time) phải duy trì ở mức ≤ 1 giây. Với thời gian lưu 40 ms, hệ thống GC chỉ có thể giám sát tối đa 25 ion đặc trưng trong một cửa sổ thời gian (tương đương khoảng 83 hoạt chất nếu mỗi chất dùng 3 ion). Trong khi đó, độ rộng đỉnh trong LC lớn hơn, cho phép thời gian chu kỳ lên tới 2,5 giây. Với thời gian lưu 20 ms, LC–MS/MS có thể thu nhận đồng thời khoảng 125 lần chuyển mảnh SRM, tương đương với khả năng phân tích hơn 300 hoạt chất trong một lần tiêm mẫu (với 2 SRM cho mỗi chất).

Thực tế, dù các con số lý thuyết có thể bị hạn chế do sự chồng lấn của các hoạt chất ở giữa sắc ký đồ, số lượng chất phân tích mà LC–MS/MS có thể bao quát trong một lần chạy vẫn cao hơn gấp 2 đến 3 lần so với GC–MS chế độ SIM.

Tóm lại, dù không có kỹ thuật nào có thể giải quyết triệt để mọi thách thức trong phân tích dư lượng, và việc phối hợp cả hai hệ thống vẫn là cần thiết, nhưng ưu thế của LC–MS/MS về phạm vi phân tích, độ nhạy, độ chọn lọc và khả năng phân tích trực tiếp không cần dẫn xuất hóa là hoàn toàn vượt trội, biến nó thành kỹ thuật tối ưu nhất hiện nay trong lĩnh vực này.

Bài viết tham khảo: https://analyticalsciencejournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/mas.20091